La partenza di questo itinerario è il santuario di La Verna, sito al margine meridionale del Parco Nazionale delle Foreste Casentinesi, una delle aree forestali più ampie e varie d'Europa, ricca di flora e fauna. 

Dal Casentino si raggiunge la catena dell'Alpe della Luna (riserva naturale regionale): vasto territorio boscoso, caratterizzato alle quote più alte dalla predominanza di faggete, mentre più in basso si trovano ampie aree prative e boschi di cerro e carpino nero. 

L'itinerario conduce quindi nell'alta Valle del fiume Tevere, territorio storicamente rilevante per il passaggio della Via Romea e per le contese collegate al suo controllo. Il corso del fiume, a mano a mano che scende verso sud, si fa sempre più ampio, affiancato da due ampie muraglie di pioppi. I versanti collinari della valle sono coperti di boschi cedui, interrotti da pascoli e arbusteti a prevalenza di ginepro. Anche in questo caso diverse sono le specie animali presenti nella zona: ci sono traccie di capriolo, della lepre bruna, dell'astore; il lupo è presente nelle aree boschive più alte, dove può trovare preda nelle popolazioni di cinghiali e caprioli.

Ultima zona dell'itinerario che si va ad attraversare, prima di giungere ad Assisi, è l'Eugubino: zona prevalentemente montuosa, ricca di bellezze naturali e tesori d'arte, attraversata sin dall'epoca preromana dalle vie di comunicazione con l'Adriatico.
L'ampia conca di Gubbio, chiusa a est dalla montagna calcarea e a ovest da più dolci rilievi collinari, è solcata da strade e fossati che testimoniano l'antica centuriazione romana; vi permangono ancora significative zone naturali sfuggite all'antropizzazione. La zona verso Valfabbrica, digradante poi verso Assisi, è formata da rilievi collinari dove boschi di rovere, carpino e cerro si alternano ad arbusteti, campi e pascoli.